Saggio biologico di anossia
Per valutare l’effetto dell’anossia sulla sopravvivenza dei pidocchi, sono stati utilizzati dieci gruppi di 30 pidocchi ciascuno. Ogni gruppo (n = 30) è stato collocato in una capsula di Petri di plastica (5 cm di diametro) ed è stato inserito in un sacchetto di plastica compatto AnaeroGenTM ​​(Oxoid Ltd, Basingstoke, Inghilterra, Regno Unito). Quindi, la bustina AnaeroGenTM ​​Compact (Oxoid Ltd, Basingstoke, Inghilterra, Regno Unito) è stata rapidamente messa nella busta. Il sistema è stato chiuso con una clip. Ogni gruppo ha sofferto di anossia per un punto temporale (H1, H3, H6, H8, H10, H12, H14, H16, H18 e H24). Ogni gruppo di test ha avuto un gruppo di controllo (n = 30) che è stato posto in una capsula di Petri in plastica in condizioni ambientali (25 ± 2 ° C, 20-50% di umidità relativa). I sacchetti sono stati quindi aperti e i pidocchi vitali e morti sono stati conteggiati separatamente (≤ 1h) per i gruppi di test e controllo, rispettivamente. La morte è stata definita come l’assenza di segni vitali come il movimento delle antenne, i movimenti delle gambe e la peristalsi intestinale. Ciascun esperimento è stato condotto tre volte.

Sopravvivenza dei pidocchi dopo l’immersione in acqua
Sette gruppi di pidocchi (n = 7–18 ciascuno) sono stati collocati in piastre di Petri di plastica (5 cm di diametro) e tenuti immersi in 10 mL di acqua di rubinetto (24 ° C) per H1 a H6 e H24. Le piastre di Petri sono state agitate delicatamente fino a quando tutti i pidocchi sono stati completamente immersi e appoggiati sul fondo, quindi coperti con il coperchio per evitare l’evaporazione dell’acqua. Dopo il periodo di immersione, è stata rimossa l’acqua e sono stati contati i pidocchi vivi o morti. Sette gruppi di pidocchi di controllo (n = 7-18 ciascuno) sono stati collocati in piastre di Petri senza acqua in condizioni ambientali (25 ± 2 ° C, 20-50% di umidità relativa) per la durata corrispondente (da H1 a H6 e H24) e sono stati elaborati in modo simile. I pidocchi da 7 a 18 utilizzati in ciascun gruppo erano di entrambi i sessi. Gli esperimenti sono stati condotti in triplice copia. La morte è stata definita come descritto sopra.

Effetto dell’immersione in acqua sugli spiracoli dei pidocchi
Tre gruppi di pidocchi (n = 3 ciascuno) sono stati collocati in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml contenente 1 ml di acqua di rubinetto e tenuti immersi per 10 minuti, 3 ore o 24 ore. I gruppi di controllo sono stati collocati in provette da 1,5 ml senza acqua. Al completamento, i pidocchi sono stati congelati a -20 ° C per preservare lo stato degli spiracoli (SEM1). Una serie simile di esperimenti (SEM2) è stata eseguita tranne per il fatto che la refrigerazione a -20 ° C è stata sostituita dall’immersione di azoto liquido per evitare un rapido movimento degli spiracoli. Dopo un rapido disgelo, i campioni sono stati montati su tronchetti di alluminio su linguette conduttive in carbonio a doppia faccia e posizionati sui tronchetti mediante un microscopio stereoscopico. I campioni sono stati analizzati utilizzando un microscopio elettronico a scansione ambientale FEI Quanta FEG 250 che opera in modalità LowVac, consentendo l’osservazione di campioni rivestiti di resina senza metallizzazione e modalità ESEM, che viene normalmente utilizzata per l’osservazione di campioni bagnati (Technology University of Compiègne, Francia). La pressione della camera era di 3 Torr, la larghezza del campo orizzontale era di 63,5 μm e la distanza di lavoro era di 10 mm con un’inclinazione di -1 °. Le immagini sono state registrate con ingrandimento di 1536 x 1103 pixel.

Penetrazione di acqua, dimeticone / ciclomethicone ed etanolo nel sistema respiratorio
La penetrazione o l’assenza di penetrazione di liquidi attraverso gli spiracoli nel sistema respiratorio è stata studiata usando una colorazione a base d’acqua, una colorazione assoluta a base di etanolo e una colorazione a base di dimeticone / ciclometicone (Pouxit®, Cooper, Francia). Quest’ultimo contiene il 4% p / p di dimeticone in una base di silicone volatile (ciclomethicone 5).

La macchia (0,1%) in acqua ed etanolo assoluto era blu brillante FCF (E133) (Meilleurduchef, Francia). La colorazione (1%) nel dimeticone / ciclomethicone era un colorante lipofilo rosso (FluoTecknic, Francia).

Nove gruppi di pidocchi (n = 3 ciascuno) sono stati collocati in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml contenente (i) 1 ml di acqua di rubinetto blu o 1 ml di etanolo assoluto blu o (ii) 1 ml di dimeticone / ciclomethicone rosso. I pidocchi sono stati tenuti immersi per 10 minuti, 30 minuti o 12 ore. I controlli consistevano in 9 gruppi di pidocchi (n = 3 ciascuno), che sono stati elaborati in modo identico, ad eccezione dell’assenza di colorante. Dopo l’immersione, i pidocchi sono stati asciugati delicatamente su una carta da filtro per assorbire l’eccesso di liquido e quindi abbondantemente sciacquati con acqua di rubinetto prima dell’esame sotto una lente d’ingrandimento binoculare.

analisi statistica
La sopravvivenza dei pidocchi dopo immersione o biotest di anossia è stata espressa come percentuale di campioni viventi. Per i biotest di immersione e anossia, il test esatto di Fisher è stato utilizzato per confrontare il tasso di sopravvivenza tra i gruppi, cercando una relazione con il tempo di immersione o esposizione dai test di Cochran-Mantel-Haenszel. Per il biotest sull’anossia, è stato utilizzato il modello ANOVA a 3 vie con interazione per verificare se il trattamento (anossia o controllo) rimane indipendente dal tempo di esposizione. Le analisi sono state eseguite a livello di p <0,05 a due code utilizzando JMP versione 10.0.0 (SAS Institute, Cary, NC, USA).

Saggio biologico di anossia
Per questo studio sono stati utilizzati 1.787 pidocchi. Complessivamente, 900 pidocchi sono stati tenuti in condizioni anossiche e 887 pidocchi sono stati utilizzati come controlli non trattati. Quelli collocati nei sacchetti anaerobici sono rimasti mobili per almeno 5 minuti. Dopo 10 minuti, la peristalsi intestinale e il movimento delle gambe / antenne hanno mostrato una riduzione dell’attività. Dopo 30–40 minuti, tutti i pidocchi apparivano completamente immobili. Dopo l’estrazione dai sacchetti anaerobici a H1, H3, H6 o H8, il 100% (360/360) dei pidocchi era vivo rispetto all’87,1% (305/350) nei gruppi di controllo abbinati (p <0,0001). Dopo H10, è stata osservata la morte nel gruppo anossico, il tasso di sopravvivenza nel gruppo anossico era inferiore del 12,2% rispetto al gruppo di controllo 48,9% (44/90). Tutti i pidocchi trattati erano morti dopo H16 rispetto a tassi di sopravvivenza del 18,9% (17/90) a H16, 11,1% (10/90) a H18 e 10% (9/90) a H24 nei gruppi di controllo non trattati.

Sopravvivenza dei pidocchi dopo l’esposizione all’anossia rispetto ai pidocchi di controllo mantenuti a temperatura ambiente.

Sopravvivenza dei pidocchi dopo immersione in acqua
Sono stati utilizzati in totale 503 pidocchi, di cui 243 sono stati immersi in acqua e 260 sono stati utilizzati come controlli non trattati. Dopo l’immersione in acqua, il movimento delle antenne e delle gambe di tutti i pidocchi è cessato in meno di 1 minuto, mentre la peristalsi intestinale è persistita per un massimo di 10 minuti, quindi i pidocchi sono sembrati completamente immobili. Tuttavia, nessuno dei 188 pidocchi immersi tra H1 e H6 era morto, nonostante la loro apparente immobilità. Dopo H24, il 50,9% (28/55) dei pidocchi immersi nell’acqua erano vivi. La mortalità era più alta nel gruppo di controllo rispetto al gruppo di test (Figura 2). Sono state registrate le dinamiche del recupero; la peristalsi intestinale e i movimenti delle antenne sono ripresi entro 5 minuti dopo 1-3 ore di immersione e dopo 10 minuti dopo 4-6 ore di immersione. Per quelli immersi per 24 ore, il 23,6% (13/55) ha mostrato un leggero movimento di gambe, antenne o peristalsi intestinale quando rilasciato dalle condizioni di immersione; 20 minuti più tardi, tutto il corpo ha convulso [43,6% (24/55)] e dopo 1 ora, il 50,9% (28/55) di questi pidocchi era vivo e pienamente attivo.

Sopravvivenza dei pidocchi dopo l’immersione in acqua da 1 a 6 ore e 24 ore rispetto ai pidocchi di controllo mantenuti a temperatura ambiente.

Effetto dell’immersione in acqua sugli spiracoli dei pidocchi
Un totale di 36 pidocchi sono stati suddivisi in 6 gruppi di studio (n = 3 ciascuno) e 6 gruppi di controllo non trattati (n = 3 ciascuno). Indipendentemente dall’esperimento specifico (immerso nell’acqua o non immerso) e dal metodo di congelamento (−20 ° C o −196 ° C), il diametro degli spiracoli toracici e addominali misurava circa 20 μm (Figura 3a) e ∼5 μm (Figura 3b), rispettivamente. Abbiamo anche notato che gli spiracoli addominali e toracici dai pidocchi immersi nell’acqua contenevano un materiale secreto (Figura 3c).

Penetrazione di acqua, dimeticone / ciclomethicone o etanolo nel sistema respiratorio
Un totale di 54 pidocchi sono stati utilizzati per questo studio. Tutti i pidocchi immersi in acqua contenente macchie (Figura 4i, j, k) hanno mostrato una totale mancanza di colorazione del sistema tracheale indipendentemente dalla durata del contatto (10 minuti, 30 minuti o 12 ore). D’altra parte, l’etanolo colorato ha colorato gli spiracoli dei pidocchi entro 10 minuti dal contatto (Figura 4a) e l’intero sistema tracheale è stato colorato dopo 30 minuti o 12 ore (Figura 4b, c). Allo stesso modo, il dimeticone colorato / ciclomethicone ha colorato gli spiracoli dei pidocchi entro 10 minuti dal contatto (Figura 4e). Dopo 30 minuti e 12 ore, l’intero sistema tracheale dei pidocchi era di colore rosso, indicando che il dimeticone / ciclometicone macchiato aveva riempito il sistema tracheale (Figura 4f, g). I pidocchi immersi in dimeticone / ciclometicone colorato o non colorato o etanolo al 100% erano tutti morti dopo immersione per 30 minuti.